กิน. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. อเล็กซานโดรวา, S.N. Elansky
เมื่อไม่นานมานี้มีการแสดงให้เห็นว่าเชื้อรา Ascomycete Ilyonectria crassa สามารถติดหัวมันฝรั่งได้ งานชิ้นนี้เป็นงานแรกที่วิเคราะห์ลักษณะทางชีววิทยาและความต้านทานต่อสารฆ่าเชื้อราบางชนิดของสายพันธุ์ I. crassa ที่แยกได้จากมันฝรั่ง ลำดับของพื้นที่เฉพาะสายพันธุ์ของสายพันธุ์“ มันฝรั่ง” ใกล้เคียงกับที่ได้รับก่อนหน้านี้สำหรับเชื้อราที่แยกได้จากรากของดอกแดฟโฟดิลโสมแอสเพนและบีชหลอดลิลลี่และใบทิวลิป เห็นได้ชัดว่าพืชป่าและสวนหลายชนิดสามารถเป็นของสงวนของ I. crassa การตรวจสอบมะเขือเทศและมันฝรั่งที่ติดเชื้อสายพันธุ์ แต่ไม่ได้ติดเชื้อในผลมะเขือเทศทั้งหมดหรือหัวมันฝรั่งที่ไม่เสียหาย นี่แสดงว่า I. crassa เป็นพยาธิที่มีบาดแผล การประเมินความต้านทานต่อยา fludioxonil, difenoconazole และ azoxystrobin ในสารอาหารพบว่ายาเหล่านี้มีประสิทธิภาพสูง
ตัวบ่งชี้ EC50 (ความเข้มข้นของสารฆ่าเชื้อราซึ่งชะลอตัวลง 2 เท่าของอัตราการเติบโตในแนวรัศมีของอาณานิคมเมื่อเทียบกับการควบคุมเชื้อรา) เท่ากับ 0.4 7.4 และ 4 มก. / ล. ตามลำดับ ความเป็นไปได้ของการพัฒนาของโรคที่เกิดจาก I. crassa ควรนำมาพิจารณาเมื่อมีการประเมินทางสัณฐานวิทยาของหัวมันฝรั่งและการพัฒนามาตรการป้องกันพืช
การพัฒนาจุลินทรีย์ที่ก่อให้เกิดโรคทำให้เกิดการสูญเสียสูงในทุกขั้นตอนของการเจริญเติบโตและการเก็บมันฝรั่ง ตามกฎแล้วเมื่อวางแผนมาตรการป้องกันเชื้อโรคที่รู้จักกันดีจะถูกนำมาพิจารณาเช่นชนิดของสกุล Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora เป็นต้นอย่างไรก็ตามในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมามีรายงานมากขึ้นเรื่อย ๆ เกี่ยวกับการปรากฏตัวของจุลินทรีย์ phytopathogenic ใหม่บนมันฝรั่ง ชีววิทยาของพวกเขาได้รับการศึกษาไม่ดีประสิทธิภาพของสารฆ่าเชื้อราที่ใช้กับมันฝรั่งไม่เป็นที่รู้จักไม่มีการพัฒนาวิธีการวินิจฉัย ด้วยการพัฒนาจำนวนมากพวกมันสามารถสร้างความเสียหายอย่างมีนัยสำคัญต่อพืชมันฝรั่ง หนึ่งในจุลินทรีย์เหล่านี้คือเชื้อรา ascomycete Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous ค้นพบครั้งแรกโดยผู้เขียนเกี่ยวกับหัวมันฝรั่ง (Chudinova et al., 2019)
งานชิ้นนี้นำเสนอผลการวิเคราะห์สายพันธุ์ I. crassa ที่แยกได้จากหัวมันฝรั่ง มีการศึกษาสัณฐานวิทยาของโคโลนีและโครงสร้างไมซีเลียลของ I. crassa ลำดับนิวคลีโอไทด์ของบริเวณดีเอ็นเอเฉพาะสายพันธุ์ความรุนแรงต่อมันฝรั่งและมะเขือเทศและความต้านทานต่อสารฆ่าเชื้อราที่เป็นที่นิยมบางชนิด
วัสดุและวิธีการ
เราใช้สายพันธุ์ I. crassa 18KSuPT2 ที่แยกได้ในปี 2018 จากหัวมันฝรั่งที่ได้รับผลกระทบที่ปลูกในภูมิภาค Kostroma หัวมันได้รับผลกระทบจากโรคโคนเน่าชนิดแห้งที่มีโพรงปกคลุมด้วยไมซีเลียมสีน้ำตาลอ่อน โดยใช้เข็มที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้วไมซีเลียมของเชื้อราจะถูกถ่ายโอนไปยังจานเพาะเชื้อด้วยอาหารเลี้ยงเชื้อ (เบียร์สาโท 10% วุ้น 1.5% เพนิซิลลิน 1000 U / ml) แผ่นเปลือกโลกถูกบ่มในความมืดที่ 24 ° C
กล้องจุลทรรศน์แบบใช้แสง Leica DM2500 พร้อมกล้องดิจิทัล ICC50 HD และกล้องจุลทรรศน์สองตา Leica M80 พร้อมกล้องดิจิทัล IC80HD (Leica Microsystems ประเทศเยอรมนี) ใช้ในการถ่ายภาพประเมินขนาดและสัณฐานวิทยาของสปอร์และอวัยวะของสปอร์
ในการแยกดีเอ็นเอไมซีเลียมของเชื้อราจะถูกปลูกในอาหารเม็ดถั่วเหลวจากนั้นแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวทำให้เป็นเนื้อเดียวกันบ่มในบัฟเฟอร์ CTAB ทำให้บริสุทธิ์ด้วยคลอโรฟอร์มและล้างด้วยแอลกอฮอล์ 2% สองครั้ง
วิธีการสกัดดีเอ็นเอมีการอธิบายรายละเอียดไว้ในบทความโดย Kutuzova et al (2017).
ในการตรวจสอบสายพันธุ์โดยวิธีการทางโมเลกุลและเปรียบเทียบกับสายพันธุ์ I. crassa อื่น ๆ ที่รู้จักกันดี PCR ได้ดำเนินการกับไพรเมอร์ที่อนุญาตให้ขยายขอบเขตดีเอ็นเอเฉพาะสายพันธุ์: ITS1-5,8S-ITS2 (ไพรเมอร์ ITS5 / ITS4, White et al., 1990) บริเวณยีน b -tubulin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) และปัจจัยการยืดตัวแปล1α (tef1α) (ไพรเมอร์ EF1-728F / EF1-986R, Carbone and Kohn, 1999) แอมพลิฟายเออร์ที่มีความยาวตามต้องการถูกสกัดจากเจลโดยใช้ชุด Evrogen CleanUp พื้นที่ขยายได้รับการจัดลำดับโดยใช้BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, USA) บนซีเควนอัตโนมัติ Applied Biosystems 3730 xl (Applied Biosystems, CA, USA) ลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ได้ถูกใช้เพื่อค้นหาการจับคู่ในฐานข้อมูล GenBank ของศูนย์ข้อมูลเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติของสหรัฐอเมริกา (NCBI) การวิเคราะห์ทางวิวัฒนาการดำเนินการโดยใช้โปรแกรม MEGA 6 (Tamura et al., 2013)
การตรวจวัดความรุนแรงดำเนินการกับผลไม้สีเขียวทั้งผลของมะเขือเทศผลใหญ่ (พันธุ์ Dubrava) และหัวมันฝรั่ง (พันธุ์กาล่า) นอกจากนี้ในการจำลองความเสียหายของผลไม้และหัวที่เสียหายเราใช้ผลไม้และหัวชนิดเดียวกัน ชิ้นหัวถูกวางไว้ในห้องชื้นซึ่งเป็นจาน Petri ที่มีกระดาษกรองเปียกอยู่ด้านล่าง สไลด์วางอยู่บนกระดาษซึ่งในทางกลับกันชิ้นส่วนของหัวหรือผลไม้ก็ถูกวางไว้ หัวและผลไม้ทั้งหมดวางไว้ในภาชนะที่มีกระดาษกรองเปียกอยู่ด้านล่าง ตรงกลางชิ้น (หรือบนพื้นผิวที่ไม่เสียหายของหัวหรือผลไม้) มีการวางวุ้น (5 × 5 มม.) ที่มีเชื้อราหลังจาก 5 วันของการเจริญเติบโตบนวุ้นสาโท
การประเมินความต้านทานของสายพันธุ์ของเชื้อราต่อสารฆ่าเชื้อราได้ดำเนินการในสภาพห้องปฏิบัติการบนอาหารเลี้ยงเชื้อวุ้น เราศึกษาความไวต่อยาฆ่าเชื้อรา Maxim, KS (สารออกฤทธิ์ fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxystrobin 250 g / l), Scor, EC (difenoconazole 250 g / l) (แค็ตตาล็อกของรัฐ ... , 2020) การประเมินได้ดำเนินการในจาน Petri บนอาหารเลี้ยงเชื้อสาโท - วุ้นโดยการเติมยาที่ศึกษาที่ความเข้มข้นของสารออกฤทธิ์ 0.1 หนึ่ง; 1 ppm (mg / L) (สำหรับ fludioxonil และ difenoconazole), 10; สิบ; 1 ppm (สำหรับ azoxystrobin) และในอาหารเลี้ยงเชื้อที่ไม่มีสารฆ่าเชื้อรา (ควบคุม) เติมสารฆ่าเชื้อราลงในอาหารที่ละลายแล้วและเย็นลงที่อุณหภูมิ 10 ° C หลังจากนั้นจึงเทสารเคมีลงในจานเพาะเชื้อ บล็อกวุ้นที่มีไมซีเลียมของเชื้อราวางอยู่ตรงกลางจานเพาะเชื้อและเพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 100 ° C ในที่มืด หลังจาก 60 วันของการฟักตัวเส้นผ่านศูนย์กลางของโคโลนีถูกวัดในสองทิศทางที่ตั้งฉากกัน ผลการวัดค่าเฉลี่ยของแต่ละอาณานิคม การทดลองดำเนินการเป็นสามเท่า จากผลการวิเคราะห์พบว่า EC24 คำนวณได้เท่ากับความเข้มข้นของสารฆ่าเชื้อราซึ่งทำให้อัตราการเติบโตในแนวรัศมีของโคโลนีลดลงครึ่งหนึ่งเมื่อเทียบกับการควบคุมเชื้อรา
ผลลัพธ์และการอภิปราย
ในจานเพาะเชื้อที่มีวุ้นสาโทเชื้อราจะสร้างอาณานิคมด้วยไมซีเลียมที่เป็นฟองสีขาว ตัวกลางใต้ไมซีเลียมเปลี่ยนเป็นสีน้ำตาลแดง เมื่อตัวกลางแห้งเชื้อราจะสร้างสปอร์สองชนิดบน conidiophores เดี่ยวและแบบรวมในสปอโรโดเคียขนาดเล็ก Macroconidia มีความยาวเป็นทรงกระบอกโดยมีหนึ่งถึงสามกะบังความยาวเฉลี่ย 27.2 µm โดยมีช่วงของค่าตั้งแต่ 23.2 ถึง 32.2 µm ความกว้างสูงสุด 4.9 µm (รูปที่ 1) ความยาวเฉลี่ยของไมโครโคนิเดียคือ 14.3 µm โดยมีช่วงค่าตั้งแต่ 10.3 ถึง 18.1 µm ความกว้างสูงสุด 4.0 µm อักขระมหภาคและจุลภาคทั้งหมดพอดีกับช่วงของการเปลี่ยนแปลงของสายพันธุ์ Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012)
ลำดับของบริเวณดีเอ็นเอเฉพาะสายพันธุ์ (ITS, b-tubulin, TEF 1α) ตรงกับลำดับของสายพันธุ์ I. crassa ที่เราศึกษาก่อนหน้านี้ (Chudinova et al., 2019, ตารางที่ 1) เพื่อศึกษาความชุกของ I. crassa ในภูมิภาคอื่น ๆ และวิเคราะห์สเปกตรัมของวัฒนธรรมที่ได้รับผลกระทบจึงมีการวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอที่คล้ายคลึงกันในฐานข้อมูล GenBank (ตารางที่ 1) การทับซ้อนกันคือ 86 ถึง 100% ลำดับของดีเอ็นเอทั้งสามบริเวณของสายพันธุ์“ มันฝรั่ง” I. crassa นั้นเหมือนกับลำดับของสายพันธุ์ที่แยกได้จากกระเปาะลิลลี่และรากนาซิสซัสในเนเธอร์แลนด์และจากรากโสมในแคนาดา เราไม่พบสายพันธุ์ I. crassa อื่นที่มีลำดับการวิเคราะห์ที่คล้ายกันสามลำดับในฐานข้อมูลแบบเปิด อย่างไรก็ตามการวิเคราะห์ลำดับ ITS และ b-tubulin ที่ฝากแสดงให้เห็นว่ามี I. crassa บนใบทิวลิปในสหราชอาณาจักร เชื้อราที่มีลำดับ ITS คล้ายคลึงกันถูกระบุในการวิเคราะห์ mycobiota ของรากแอสเพนในแคนาดาและรากบีชในอิตาลีหัวมันฝรั่งในซาอุดีอาระเบีย (ตารางที่ 1) ผลการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่า I. crassa มีการกระจายพันธุ์ทั่วโลกและสามารถแพร่กระจายพันธุ์พืชต่างๆได้
เมื่อพิจารณาความสามารถในการก่อโรคของมะเขือเทศและมันฝรั่งในวันที่ 5 เส้นผ่านศูนย์กลางของรอยโรคสูงถึง 1.5 ซม. สายพันธุ์ที่ตรวจสอบไม่ได้ติดเชื้อในผลมะเขือเทศทั้งหมดและหัวมันฝรั่งที่ยังคงสภาพสมบูรณ์ อย่างไรก็ตามกลีบเลี้ยงได้รับผลกระทบกับมะเขือเทศ เพื่อไม่รวมความเป็นไปได้ของการปนเปื้อนเชื้อราที่แยกได้จากไมซีเลียมที่พัฒนาบนชิ้นหัวมันฝรั่งจะถูกแยกเป็นวัฒนธรรมบริสุทธิ์ มันเหมือนกับความเครียดของผู้ปกครองโดยสิ้นเชิง เห็นได้ชัดว่า I. crassa เป็นปรสิตที่มีบาดแผล
การรักษาหัวเมล็ดด้วยสารฆ่าเชื้อราก่อนการปลูกจะช่วยลดการพัฒนาของโรคในพืชในช่วงฤดูปลูก สำหรับการเลือกใช้ยาฆ่าเชื้อราที่มีประสิทธิภาพเป็นสิ่งสำคัญที่จะต้องประเมินว่ายาชนิดใดมีผลกับ I. сrassa งานนี้ศึกษาสารออกฤทธิ์ที่แพร่หลายของสารฆ่าเชื้อรา - fludioxonil, azoxystrobin, difenoconazole Fludioxonil รวมอยู่ในสารผสมหลายชนิดที่ใช้สำหรับแต่งเมล็ดและหัวเมล็ดก่อนปลูก Fludioxonil (Maxim) ยังใช้ในการรักษาหัวเมล็ดก่อนการเก็บรักษา Difenoconazole และ azoxystrobin รวมอยู่ในการเตรียมการหลายอย่างที่ใช้สำหรับการแปรรูปวัสดุเมล็ดเช่นเดียวกับการเตรียมการสำหรับการแปรรูปพืชผัก (แคตตาล็อกของรัฐ ... , 2020)
อัตราการเติบโตของ I. crassa ได้รับการศึกษาบนอาหารเลี้ยงเชื้อ (รูปที่ 2) ที่มีความเข้มข้นของสารออกฤทธิ์ต่างกัน: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxystrobin (EC50 = 4 ppm) และ difenoconazole (EC50 = 7.4 ppm) (ตารางที่ 2) การเตรียมการเหล่านี้ถือได้ว่ามีประสิทธิภาพสูงเมื่อเทียบกับ I. crassa เนื่องจาก EC50 ของพวกเขาต่ำกว่าความเข้มข้นที่แนะนำของสารเตรียมในของเหลวที่ใช้ในการรักษาหัวอย่างมีนัยสำคัญ ตามแคตตาล็อกของรัฐ ... (2020) ความเข้มข้นของ fludioxonil ในของเหลวสำหรับรักษาหัวมันฝรั่งอยู่ที่ 500 ถึง 1000 ppm, azoxystrobin (ในของเหลวสำหรับรักษาก้นร่อง) - 3750-9375 ppm, difenoconazole (ในของเหลวสำหรับรักษาพืชผัก) - 187.5– 625 แผ่นต่อนาที
ตารางที่ 1. ความคล้ายคลึงกันของลำดับขั้นเฉพาะของสายพันธุ์ 18KSuPT2 และสายพันธุ์ของ Ilyonectria crassa ที่มีอยู่ในฐานข้อมูล Genbank
ความเครียด | โรงงานโฮสต์สถานที่ขับถ่าย | หมายเลขลำดับที่ฝากใน GenBank เปอร์เซ็นต์ของความคล้ายคลึงกัน | ลิงค์ | ||
ITS | β-tubulin | TEF 1α | |||
17KSPT1 และ 18KSuPT2 | หัวมันฝรั่งภูมิภาค Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019 งานนี้ |
ซีบีเอส 158/31 | รากนาร์ซิสซัสเนเธอร์แลนด์ | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | คาบราล และคณะ 2012 |
ซีบีเอส 139/30 | Lily bulb ประเทศเนเธอร์แลนด์ | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | รากโสมแคนาดา | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS 235138 | ทิวลิปใบไม้สหราชอาณาจักร | KJ475469 100 | KJ513266 100 | ND | เดนตันเดนตัน 2014 |
MT294410 | รากแอสเพนแคนาดา | MT294410 100 | ND | ND | แรมส์ฟิลด์ และคณะ, 2020 |
ER1937 | บีชอิตาลี | KR019363 99.65 | ND | ND | Tizzani, Haegi, Motta ส่งตรง |
KAUF 19 | หัวมันฝรั่งซาอุดีอาระเบีย | HE649390 98.3 | ND | ND | กัชการี, Gherbawy, 2013 |
ND = ไม่ได้ฝาก
ตารางที่ 2. ความต้านทานของ Ilyonectria crassa ต่อสารฆ่าเชื้อรา
(สารออกฤทธิ์) | EC50, หน้าต่อนาที | ||||
วัน 3 | วัน 5 | วัน 7 | |||
ควบคุม | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
ควอดริส, แคนซัส (fsoxystrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, แคนซัส (fludioxonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Skor, EC (ไดเฟโนโคนาโซล) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
ในงานของเราสายพันธุ์ I. crassa ถูกแยกออกจากหัวมันฝรั่งในภูมิภาค Kostroma และมอสโกว (Chudinova et al., 2019) มีการเปิดเผยสายพันธุ์เชื้อราที่มีลำดับ ITS ที่เหมือนกับ I. crassa ในสัดส่วนที่สูงเมื่อวิเคราะห์ mycobiota ของหัวมันฝรั่งในซาอุดิอาระเบีย (Gashgari and Gherbawy, 2013) เห็นได้ชัดว่า I. crassa ไม่ใช่มันฝรั่งที่หายากอย่างที่คิด การทดลองของเราพบว่าเชื้อราสามารถติดผลมะเขือเทศที่เสียหายได้ เป็นที่ทราบกันดีจากวรรณกรรมว่า I. crassa มีความสามารถในการพัฒนา saprotrophically ในดิน (Moll et al., 2016) รวมทั้งส่งผลกระทบต่อพืชหลายชนิดแม้กระทั่งพืชที่อยู่ห่างไกลอนุกรมวิธานเช่นแดฟโฟดิลลิลลี่โสมแอสเพนและบีช (ตารางที่ 1) หนึ่ง). เห็นได้ชัดว่าพืชป่าและสวนหลายชนิดสามารถเป็นของสงวนของ I. crassa ข้างต้นแสดงให้เห็นว่าเมื่อมีการพัฒนามาตรการป้องกันจำเป็นต้องคำนึงถึงความเป็นไปได้ที่จะส่งผลกระทบต่อหัวมันฝรั่งด้วยเชื้อรานี้ การเตรียมการอย่างแพร่หลายสำหรับการรักษาหัวมันฝรั่งที่มี fludioxonil, azoxystrobin และ difenoconazole แสดงให้เห็นถึงประสิทธิภาพในการฆ่าเชื้อราที่สูงต่อเชื้อ I. crassa
งานนี้ได้รับการสนับสนุนจาก Russian Foundation for Basic Research (Grant No. 20-016-00139)
บทความนี้ตีพิมพ์ในวารสาร "Plant Protection Bulletin", 2020, 103 (3)