D. Yu Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
เชื้อราที่ทำให้เกิดโรคเชื้อรา Colletotrichum coccodes เป็นสาเหตุของโรคที่เป็นอันตรายในมันฝรั่งและมะเขือเทศที่เรียกว่าโรคแอนแทรคโนสและหัวดำ โดยลักษณะทางสัณฐานวิทยามักแยกจากโรคที่เกิดจากจุลินทรีย์อื่นได้ยาก ในผลมะเขือเทศสีเขียวโรคนี้อาจไม่มีอาการแสดงให้เห็นเฉพาะในผลไม้สีแดงสุก เพื่อการวินิจฉัยที่รวดเร็วและแม่นยำของเชื้อโรคมีการนำเสนอระบบทดสอบ PCR แบบเรียลไทม์ ในการพัฒนาระบบทดสอบได้กำหนดลำดับนิวคลีโอไทด์ของยีนกลีเซอรอลไตรฟอสเฟตดีไฮโดรจีเนสที่มีโคโคด 45 สายพันธุ์ที่แยกได้จากหัวมันฝรั่งในภูมิภาคต่างๆของรัสเซีย
จากผลที่ได้รับและการวิเคราะห์ลำดับที่คล้ายคลึงกันของสิ่งมีชีวิตอื่น ๆ ที่มีอยู่ในฐานข้อมูล GenBank ไพรเมอร์และโพรบสำหรับ C. coccodes เฉพาะได้รับการออกแบบ เพื่อทดสอบความจำเพาะของระบบทดสอบที่สร้างขึ้น PCR ได้ดำเนินการกับ DNA ที่แยกได้จากวัฒนธรรมบริสุทธิ์ของเชื้อราปรสิตและซาโปรโทรฟิค 15 ชนิดที่เกี่ยวข้องกับพืชมะเขือเทศและมันฝรั่ง (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides) การปรากฏตัวของ Colletotrichum coccodes DNA ถูกกำหนดที่รอบขีด จำกัด 20–27 ในขณะที่สายพันธุ์อื่นถูกตรวจพบหลังจาก 40 รอบหรือตรวจไม่พบ ระบบทดสอบทำให้สามารถตรวจจับความเข้มข้นของดีเอ็นเอของ C. coccodes ที่เกิน 0.01 นาโนกรัม / ลบ.ม. ในส่วนผสม PCR ที่วิเคราะห์ได้อย่างน่าเชื่อถือ จากการใช้ระบบทดสอบที่พัฒนาขึ้นพบว่ามี C. coccodes ในใบมะเขือเทศที่มีอาการของโรคเชื้อราและในหัวมันฝรั่งที่ไม่มีอาการภายนอกของโรค ใบที่มีอาการของการติดเชื้อราถูกรวบรวมจากสองสาขาในดินแดนครัสโนดาร์หัว - จากทุ่งใน Kostroma, มอสโก, คาลูกา, ภูมิภาค Nizhny Novgorod พบใบมะเขือเทศหนึ่งใบที่มี DNA ของ C. coccodes ในดินแดนครัสโนดาร์ มีการตรวจพบดีเอ็นเอของเชื้อโรคนี้อย่างมีนัยสำคัญใน 3 ตัวอย่างของหัวที่ปลูกในภูมิภาค Kostroma, Moscow, Kaluga
การแนะนำ
เชื้อราในสกุล Colletotrichum เป็นไฟโตที่เป็นอันตรายซึ่งมีผลต่อธัญพืชผักสมุนไพรผลไม้ยืนต้นและพืชตระกูลเบอร์รี่ หนึ่งในสายพันธุ์ที่แพร่หลายของสกุลนี้ Colletotrichum coccodes (Wallr)
ฮิวจ์เป็นสาเหตุของโรคแอนแทรคโนสและจุดดำของมันฝรั่งและมะเขือเทศและทำให้เกิดโรคของพืชอื่น ๆ ในตระกูล Solanaceae รวมทั้ง วัชพืช (Dillard, 1992) C. coccodes มีผลต่อส่วนใต้ดินของพืชฐานลำต้นใบและผลไม้ (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994) บนเปลือกของหัวมันฝรั่งที่ติดเชื้อจะสังเกตเห็นการพัฒนาของจุดสีเทาที่มีขอบที่เด่นชัดซึ่งมองเห็นจุดสีดำของการสร้างสปอร์และกล้องจุลทรรศน์ได้อย่างชัดเจน ในระหว่างการเก็บรักษาแผลที่มีเนื้อนิ่มอาจก่อตัวในเนื้อของหัวได้เช่น โรคนี้เข้าสู่ระยะแอนแทรคโนสซึ่งหายากมาก
ในขณะเดียวกันอาการของโรคแอนแทรคโนส (แผลที่ผิวหนังที่มีจุดสีดำเล็ก ๆ ) มักเกิดกับผลมะเขือเทศ บนใบอาการของ C. coccodes จะปรากฏเป็นจุดสีน้ำตาลเข้มซึ่งมักมีเนื้อเยื่อสีเหลืองล้อมรอบ (Johnson, 1994)
การพัฒนาของจุดดำบนหัวทำให้เสียรูปลักษณ์ซึ่งจะเด่นชัดโดยเฉพาะเมื่อขายมันฝรั่งเปลือกแดงที่ล้างแล้ว การขัดผิวทำให้เกิดการระเหยส่วนเกินและการสูญเสียพื้นที่เก็บข้อมูลเพิ่มขึ้น (Hunger, McIntyre, 1979) ความเสียหายต่ออวัยวะอื่น ๆ ของพืชนำไปสู่การสูญเสียผลผลิตซึ่งสังเกตได้ทั้งในพื้นที่เปิดและปิด (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999) โรคที่เกิดจาก C. coccodes พบได้บ่อยในภูมิภาคที่ผลิตมันฝรั่งเกือบทั้งหมดของโลกรวมถึงรัสเซีย (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018) การควบคุมโรคเหล่านี้ทำได้ยากเนื่องจากยาฆ่าเชื้อราที่มีอยู่ไม่เพียงพอต่อเชื้อ C. coccodes และพันธุ์ที่ต้านทานไม่ได้ (อ่านซ่อน 1995)
หัวเชื้อ C. coccodes สามารถคงอยู่ในหัวเมล็ดได้ (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997) เมล็ดมะเขือเทศ (Ben-Daniel et al., 2010) อยู่รอดได้นานในดินบนเศษซากพืช (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) และในวัชพืช (Raid, Pennypacker, 1987) ผลงานของผู้เขียนหลายคน (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) แสดงให้เห็นว่าการพัฒนาของโรคในมันฝรั่งและมะเขือเทศส่วนใหญ่ขึ้นอยู่กับการมีอยู่ของหัวเชื้อในเมล็ดและ ดิน. ดังนั้นเพื่อลดความสูญเสียจากโรคให้น้อยที่สุดจึงจำเป็นต้องวินิจฉัย (รวมถึงเชิงปริมาณ) ของเชื้อราในวัสดุเพาะเมล็ดในดินในหัวมันฝรั่งเมล็ดและเมล็ดมะเขือเทศที่วางไว้เพื่อการจัดเก็บ การวินิจฉัยทางสัณฐานวิทยาในดินและวัสดุปลูกสามารถทำได้โดยการมี microsclerotia เท่านั้นซึ่งพบได้ในเชื้อราประเภทอื่นด้วย
อาการบนหัวจะคล้ายกับสะเก็ดเงินที่เกิดจากเชื้อรา Helminthosporium solani การแยก Colletotrichum coccodes และ Helminthosporium solani เข้าสู่วัฒนธรรมบริสุทธิ์นั้นค่อนข้างยากและใช้เวลานานเนื่องจากการเจริญเติบโตช้าบนอาหารที่เป็นสารอาหาร ในการระบุ Colletotrichum coccodes อย่างรวดเร็วจำเป็นต้องใช้วิธีการวินิจฉัยด้วยเครื่องมือ วิธีที่สะดวกที่สุดคือปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) และการปรับเปลี่ยน - PCR แบบเรียลไทม์ ปัจจุบันระบบทดสอบที่พัฒนาโดยนักวิจัยชาวอังกฤษ (Cullen et al., 2002) สำหรับภูมิภาค ITS1 ของ rDNA ถูกใช้ในยุโรปและสหรัฐอเมริกา การใช้งานได้แสดงผลลัพธ์ที่ดีในการวิเคราะห์ไอโซเลทของรัสเซีย (Belov et al, 2018) อย่างไรก็ตาม C. coccodes มีความแปรปรวนสูงและการตรวจพบจากลำดับดีเอ็นเอเดียวอาจนำไปสู่ผลลัพธ์เชิงลบที่ผิดพลาด เพื่อการวินิจฉัยที่น่าเชื่อถือยิ่งขึ้นจำเป็นต้องวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอเฉพาะสายพันธุ์หลายชนิดซึ่งเราได้พัฒนาระบบการทดสอบดั้งเดิมที่ช่วยให้เราระบุรหัส C. coccodes ตามลำดับของยีน glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
วัสดุและวิธีการ
เพื่อประเมินประสิทธิภาพและความจำเพาะของระบบทดสอบที่สร้างขึ้นเราใช้การเพาะเลี้ยงบริสุทธิ์ของเชื้อรา 15 ชนิดที่ผู้เขียนแยกได้จากตัวอย่างใบมะเขือเทศและผลไม้ที่เป็นโรคหัวมันฝรั่ง (ตารางที่ 1) สำหรับการแยกอวัยวะของพืชที่มีอาการของการติดเชื้อราถูกนำมาไม่เกินหนึ่งอวัยวะต่อพุ่มไม้
ชิ้นหัวที่มีเปลือกผลมะเขือเทศชิ้นหนึ่งและใบไม้ที่ได้รับผลกระทบถูกวางไว้ใต้กล้องจุลทรรศน์สองตาหลังจากนั้นไมซีเลียมสปอร์หรือชิ้นส่วนของเนื้อเยื่อจะถูกถ่ายโอนไปยังอาหารเลี้ยงเชื้อ (สาโทวุ้น) ในจานเพาะเชื้อด้วยเข็มผ่าที่แหลมขึ้น ไอโซเลทถูกเก็บไว้ในวุ้นเอียงในหลอดทดลองที่อุณหภูมิ 4 ° C
ตัวอย่างใบมะเขือเทศที่มีอาการของโรคเชื้อราที่มีไว้สำหรับการวิเคราะห์ทันทีหลังการเก็บ (ในสนาม) ถูกวางไว้ในเอทิลแอลกอฮอล์ 70% ซึ่งเก็บไว้จนกว่าจะแยกดีเอ็นเอ หัวมันฝรั่งถูกส่งไปยังห้องปฏิบัติการปอกเปลือก (ชิ้น 2 × 1 ซม.) จากพวกมันและแช่แข็งที่อุณหภูมิ –20 °С เก็บไว้แช่แข็งจนกว่าจะแยกดีเอ็นเอ
การเพาะเชื้อราบริสุทธิ์สำหรับการแยกดีเอ็นเอปลูกในอาหารเม็ดถั่ว ไมซีเลียมของเชื้อราถูกกำจัดออกจากตัวกลางที่เป็นของเหลวทำให้แห้งบนกระดาษกรองแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวทำให้เป็นเนื้อเดียวกันบ่มในบัฟเฟอร์ CTAB ทำให้บริสุทธิ์ด้วยคลอโรฟอร์มตกตะกอนด้วยส่วนผสมของไอโซโพรพานอลและโพแทสเซียมอะซิเตต 0.5 M ล้างสองครั้งด้วยแอลกอฮอล์ 2% ดีเอ็นเอที่ได้จะละลายในน้ำปราศจากไอออนและเก็บไว้ที่ –70 °С (Kutuzova et al., 20) วัดความเข้มข้นของดีเอ็นเอโดยใช้ชุดตรวจหาปริมาณดีเอ็นเอ HS สำหรับดีเอ็นเอที่ควั่นคู่บน Qubit 2017 (Qiagen ประเทศเยอรมนี) ตัวอย่างที่ถูกทำให้เป็นแอลกอฮอล์และแช่แข็งจะถูกทริทูทในไนโตรเจนเหลวจากนั้นทำการสกัดดีเอ็นเอตามที่อธิบายไว้ข้างต้น (สำหรับไมซีเลียมของเชื้อราบริสุทธิ์)
ตารางที่ 1. ต้นกำเนิดของสายพันธุ์เชื้อราที่ใช้แล้ว
ชื่อเห็ด | พืชอวัยวะ | สถานที่เลือก |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | หัวมันฝรั่ง | ภูมิภาค Kostroma หัวมันฝรั่งรุ่นที่ 1 พันธุ์ Red Scarlett |
คอลเลโตทริคัม โคโคด 4 | ใบมันฝรั่ง | ตัวแทน Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | หัวมันฝรั่ง | ภูมิภาคมากาดาน, pos. เต็นท์หัวมันฝรั่ง |
คลาโดสปอเรียม ฟูลวัม | ใบมะเขือเทศ | ภูมิภาคมอสโกมะเขือเทศผลใหญ่ |
Alternaria Tomatophila | ผลไม้มะเขือเทศ | ส่งมอบโดยเจ้าหน้าที่ของห้องปฏิบัติการด้านเนื้องอกวิทยาและพืชวิทยาของ All-Russian Research Institute of Plant Protection |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | ผลไม้มะเขือเทศ | Krasnodar Territory เขต Krymsky เกรด Cream |
ฟิวซาเรียม ออกซีสปอรัม | รากข้าวสาลี | ภาคมอสโก |
PCR ดำเนินการบนแอมพลิฟายเออร์ DTprime (DNA-Technology) สำหรับ PCR จะใช้ไพรเมอร์ดั้งเดิมและหัววัดสำหรับบริเวณเฉพาะสายพันธุ์ของยีนกลีเซอรอลไตรฟอสเฟตดีไฮโดรจีเนส: ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA ไพรเมอร์ย้อนกลับ Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1 ไพรเมอร์ขยายขอบเขต 213 bp
ปฏิกิริยานี้ใช้ 50 นาโนกรัมของดีเอ็นเอทั้งหมด (เมื่อวิเคราะห์ใบและหัว) และ 10 นาโนกรัม (เมื่อวิเคราะห์ดีเอ็นเอของเชื้อราบริสุทธิ์) ส่วนผสมของปฏิกิริยา (35 ไมโครลิตร) ถูกคั่นด้วยชั้นพาราฟินออกเป็นสองส่วนส่วนล่าง (20 μl) มีบัฟเฟอร์ปฏิกิริยา 2 × 10 ไมโครลิตร (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM ของ deoxynucleotide triphosphate แต่ละตัว, 7 pmol ของไพรเมอร์แต่ละตัวและ 4 pmol ของหัววัดเรืองแสงที่ย่อยสลายได้ อันบนมีบัฟเฟอร์ PCR 1 × 10 ไมโครลิตรและ 1 U ของ Taq polymerase
การแยกส่วนผสมด้วยพาราฟินช่วยให้สามารถเก็บหลอดไว้ได้นานที่อุณหภูมิ 5 ° C และเพื่อให้ PCR เริ่มร้อนหลังจากให้ความร้อนเป็นเวลา 10 นาทีที่อุณหภูมิสูงกว่า 80 ° C PCR ดำเนินการตามโปรแกรมต่อไปนี้: 94.0 ° C - 90 วินาที (1 รอบ); 94.0 ° C - 30 วินาที; 64.0 ° C - 15 วินาที (5 รอบ); 94.0 ° C - 10 วิ; 64.0 ° C - 15 วินาที (45 รอบ); 10.0 ° C - การเก็บรักษา
ผลลัพธ์และการอภิปราย
ลำดับยีนของกลีเซอรอลไตรฟอสเฟตดีไฮโดรจีเนสถูกกำหนดใน 45 สายพันธุ์ที่แยกได้จากใบลำต้นหัวมันฝรั่งและผลมะเขือเทศ (Kutuzova, 2018) ในภูมิภาคต่างๆของรัสเซีย ลำดับการตรวจสอบของทุกสายพันธุ์แบ่งออกเป็น 2 กลุ่มที่แตกต่างกันในสองนิวคลีโอไทด์ ลำดับนิวคลีโอไทด์ของตัวแทนของทั้งสองกลุ่มภายใต้หมายเลข KY496634 และ KY496635 ได้รับการฝากไว้ใน GenBank
ไพรเมอร์ coc70gdf, coc280gdr และโพรบ cocgdz ที่ออกแบบบนพื้นฐานได้รับการตรวจสอบโดยใช้โปรแกรม BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) ในลำดับทั้งหมดของยีนกลีเซอรอลไตรฟอสเฟตดีไฮโดรจีเนสของชนิดของสกุล Colletotrichum และสิ่งมีชีวิตอื่น ๆ ที่มีอยู่ในฐานข้อมูล GenBank
ไม่พบบริเวณดีเอ็นเอของสิ่งมีชีวิตอื่นที่มีความคล้ายคลึงกันอย่างมากกับไพรเมอร์และโพรบ
ความไวของระบบทดสอบได้รับการตรวจสอบโดยใช้ตัวอย่างที่มีความเข้มข้นต่างกันของ C. coccodes DNA, DNA ของใบมันฝรั่งที่ติดเชื้อแอนแทรกโนส (เก็บในปี 2017 ใน Mari El, พันธุ์ Red Scarlett) และเปลือกของหัวที่ได้รับผลกระทบจากจุดดำ (เก็บในภูมิภาค Kostroma, พันธุ์ Red Scarlett ตารางที่ 2) เพื่อยืนยันการมีอยู่ของดีเอ็นเอในหัวและใบมันฝรั่งสายพันธุ์ C. coccodes ถูกแยกจากพวกมันเข้าสู่วัฒนธรรมบริสุทธิ์
ผลการวิเคราะห์ความไวของระบบทดสอบแสดงให้เห็นว่าสามารถใช้เพื่อวินิจฉัยการมีอยู่ของ C. coccodes DNA ในตัวอย่างได้สำเร็จหากเนื้อหาทั้งหมดในส่วนผสมของ PCR มากกว่า 0.05 นาโนกรัม สิ่งนี้ค่อนข้างเพียงพอสำหรับการตรวจจับเนื่องจาก sclerotia หนึ่งตัวมีโดยเฉลี่ย 0.131 ng และหนึ่งสปอร์มี DNA ประมาณ 0.04 ng (Cullen et al., 2002) ระบบทดสอบที่พัฒนาโดยกลุ่มภาษาอังกฤษ (Cullen et al., 2002) มีความไวใกล้เคียงกัน (รอบขีด จำกัด 34 ที่ 0.05 ng DNA และ 37 ที่ 0.005 ng)
การวิเคราะห์ตัวอย่างธรรมชาติที่มี C. coccodes ในทุกกรณีทำให้สามารถเปิดเผยการมีอยู่ในตัวอย่างได้อย่างน่าเชื่อถือ (ตารางที่ 2) วิธีการที่นำเสนอสำหรับการแยกดีเอ็นเอยังสามารถใช้ได้กับการวิเคราะห์ตัวอย่างพืชธรรมชาติ
ตารางที่ 2. การกำหนดความไวของระบบทดสอบที่เสนอสำหรับการระบุโคลเลตโตตริคัมโคโคดสำหรับ PCR แบบเรียลไทม์
ตัวอย่าง | ปริมาณดีเอ็นเอในตัวอย่าง *, ng | รอบเกณฑ์ | C. การตรวจหา coccodes |
---|---|---|---|
ไมซีเลียม Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
เปลือกหัว 1 | 50 | 32 | + |
เปลือกหัว 2 | 50 | 30 | + |
เปลือกหัว 3 | 50 | 31.5 | + |
ใบมันฝรั่ง | 50 | 29.5 | + |
บันทึก. * ในส่วนผสมของผลิตภัณฑ์ PCR
ความจำเพาะของระบบทดสอบได้รับการทดสอบกับตัวอย่างดีเอ็นเอที่สกัดจากเชื้อรา 15 ชนิด ผู้เขียนแยกเชื้อราทุกสายพันธุ์จากผลไม้และใบมะเขือเทศหัวมันฝรั่งที่ได้รับผลกระทบและดีต่อสุขภาพ หนึ่งสายพันธุ์ถูกแยกออกจากรากข้าวสาลี (ตารางที่ 1) ในบรรดามะเขือเทศที่แยกได้จากผิวผลมีสายพันธุ์ที่ไม่ก่อให้เกิดโรคสำหรับมะเขือเทศ (เช่น Phellinus ferrugineovelutinus)
จากการศึกษาพบว่า DNA ของ C. coccodes ถูกตรวจพบที่รอบขีด จำกัด 20–27 ในขณะที่เชื้อราชนิดอื่นไม่ได้รับการตรวจพบหรือให้สัญญาณหลังจากรอบ 40 ซึ่งสามารถนำมาประกอบกับผลกระทบที่ไม่เฉพาะเจาะจง (ตารางที่ 3)
ตารางที่ 3. การตรวจสอบระบบการทดสอบสำหรับเห็ดชนิดต่างๆ
ชื่อเห็ด | รอบเกณฑ์ |
คอลเลโตทริคุมค็อคโคด 1 | 20.9 |
ค. coccodes 2 | 22.6 |
ค. coccodes 3 | 23 |
ค. coccodes 4 | 22 |
ฟิวซาเรียม ออกซีสปอรัม | > 40 |
F. แนวดิ่ง | > 40 |
ไรโซคโทเนียโซลานี | > 40 |
โฟโมซิส เฟสโอลี | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
ก. tomatophila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
ฟีลลินัส เฟอร์รูจินีโอเวลูตินัส | > 40 |
สเตมฟิเลียม เวสซิคาเรียม | > 40 |
อิลิโอเนกเทรีย คราสซา | > 40 |
คลาโดสปอเรียม cladosporioides | > 40 |
ค. fulvum | > 40 |
อะโครดอนเทียม ลูซูเล | > 40 |
Penicillium SP | > 40 |
บันทึก. * ปริมาณดีเอ็นเอในตัวอย่างทั้งหมดเท่ากับ 10 นาโนกรัม
ระบบทดสอบที่พัฒนาขึ้นนี้ใช้เพื่อระบุ C. coccodes ในตัวอย่างใบมะเขือเทศที่มีอาการของเชื้อโรคในเนื้อสัตว์และหัวมันฝรั่งเมล็ดโดยไม่มีอาการปรากฏให้เห็น สำหรับการศึกษาเราได้นำหัวเมล็ดพันธุ์ต่างๆที่ปลูกใน Kostroma, Moscow, Kaluga, Nizhny Novgorod การปรากฏตัวของดีเอ็นเอ C. coccodes ถือว่ามีนัยสำคัญในตัวอย่างในการวิเคราะห์ซึ่งรอบเกณฑ์ไม่เกิน 35 ค่าเกณฑ์นี้ได้รับการคัดเลือกจากการกำหนดที่เชื่อถือได้ของดีเอ็นเอ coccodes 0.05 นาโนกรัม (รอบเกณฑ์ที่ 33.5 ตารางที่ 2) และข้อเท็จจริงที่ว่า ที่รอบเกณฑ์ที่สูงกว่า 40 จะมีการวินิจฉัยดีเอ็นเอที่ไม่เฉพาะเจาะจงของเชื้อราชนิดอื่น ๆ ด้วยวิธีนี้ตรวจพบการปรากฏตัวของดีเอ็นเอ C. coccodes อย่างมีนัยสำคัญใน 5 ตัวอย่างของหัวที่ปลูกใน Kostroma, มอสโก, ภูมิภาค Kaluga และในใบมะเขือเทศหนึ่งใบจากเขต Yeisk ของภูมิภาค Krasnodar (ตารางที่ 4, 5)
ตารางที่ 4. การตรวจหาโคเลโทตริคัมบนหัวมันฝรั่ง *
หมายเลขตัวอย่าง | มันฝรั่งหลากหลาย | สถานที่ของการเจริญเติบโต | C. การตรวจหา coccodes | รอบเกณฑ์ |
---|---|---|---|---|
1 | สีแดงสีแดง | ภูมิภาค Kostroma | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | ภาคมอสโก | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky ต้น | ภาคมอสโก | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | มอลลี่ | ภูมิภาค Kaluga | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | จินตนาการ | ภูมิภาค Kaluga | - | |
15 | รื่นเริง | Nizhny Novgorod ภูมิภาค | - | |
16 | - |
บันทึก. * ปริมาณดีเอ็นเอในตัวอย่างทั้งหมดเท่ากับ 50 นาโนกรัม
ตารางที่ 5. การตรวจหาโคเลโทตริคัมบนใบมะเขือเทศ *
หมายเลขตัวอย่าง | สถานที่ของการเจริญเติบโต | C. การตรวจหา coccodes | รอบเกณฑ์ |
---|---|---|---|
1 | Krasnodar Territory, Crimean District | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | ภูมิภาค Krasnodar เขต Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* ปริมาณดีเอ็นเอในตัวอย่างทั้งหมดเท่ากับ 50 นาโนกรัม
ระบบทดสอบที่เราสร้างขึ้นนั้นไม่ได้ด้อยไปกว่าที่พัฒนาโดยนักวิจัยชาวอังกฤษ (Cullen et al., 2002) ในด้านความไวและความจำเพาะและเหมาะสำหรับการวิเคราะห์ตัวอย่างพืช การประยุกต์ใช้ในการวิเคราะห์หัวเมล็ดทำให้สามารถระบุ DNA ของ C. coccodes ในหัวโดยไม่มีร่องรอยความเสียหายภายนอกและวิเคราะห์การติดเชื้อของใบได้สำเร็จ
จนถึงปัจจุบันยังไม่มีการวิเคราะห์หัวมันฝรั่งสำหรับการเข้าทำลายของ C. coccodes ในรัสเซีย การศึกษาครั้งแรกของเราแสดงให้เห็นว่าจากหัวเมล็ดที่ผ่านการทดสอบ 16 ชนิดที่ปลูกในภูมิภาคต่างๆของสหพันธรัฐรัสเซีย 5 ชนิดมี C. coccodes สิ่งนี้แสดงให้เห็นว่าหัวมันฝรั่งจุดดำเป็นโรคมันฝรั่งที่พบบ่อยในรัสเซียและบทบาทในการลดปริมาณและคุณภาพของมันฝรั่งนั้นต่ำเกินไป
การวิเคราะห์ใบมะเขือเทศพบว่ามี DNA ของ C. coccodes อย่างมีนัยสำคัญในใบเดียวจากเขต Yeisk ของ Krasnodar Territory ก่อนหน้านี้เมื่อตรวจสอบไร่มะเขือเทศทางตอนใต้ของรัสเซียโดยใช้ระบบทดสอบของอังกฤษ (Cullen et al., 2002) พบใบที่มี C. coccodes และในบางสาขาพบว่ามีใบที่ติดเชื้อ C. coccodes ในสัดส่วนสูง (Belov et al., 2018). ใน Krasnodar และ Primorsky Territories ภูมิภาคมอสโกเราพบผลมะเขือเทศซึ่งเราสามารถแยกวัฒนธรรมบริสุทธิ์ของ C. coccodes ได้ เป็นไปได้ว่า C. coccodes แพร่หลายในมะเขือเทศในรัสเซียมากกว่าที่เชื่อกันในปัจจุบันและความเป็นอันตรายของมันก็ถูกประเมินต่ำเกินไป
ดังนั้นในปัจจุบันจึงมีการสะสมข้อมูลเพียงพอเกี่ยวกับการกระจายตัวของ C. coccodes ในมันฝรั่งและมะเขือเทศ
เพื่อให้เข้าใจถึงบทบาทของเชื้อรานี้ในการพัฒนาโรคมันฝรั่งและมะเขือเทศได้ดียิ่งขึ้นจำเป็นต้องติดตามความชุกในรัสเซียศึกษาบทบาทของการติดเชื้อในดินและเมล็ดพืชและบทบาทของจุดดำในการสูญเสียระหว่างการเก็บรักษา การใช้การวินิจฉัย PCR สามารถอำนวยความสะดวกในงานนี้ได้อย่างมากและการใช้ระบบทดสอบทั้งสองพร้อมกันจะช่วยเพิ่มความแม่นยำในการวิเคราะห์ได้อย่างมาก
งานนี้ได้รับการสนับสนุนทุนจาก Russian Science Foundation No. 18-76-00009
บทความนี้ตีพิมพ์ในวารสาร "Mycology and Phytopathology" (เล่มที่ 54, ฉบับที่ 1, 2020)